Vorbereitung von Proteinproben für die Massenspektrometrie

Vorbereitung von Proteinproben für die Massenspektrometrie

Bei der Vorbereitung einer Proteinprobe für die Massenspektrometrie ist eine Reihe von Faktoren zu beachten. Bei der Entwicklung einer Strategie für die Probenvorbereitung sollten folgende Faktoren berücksichtigt werden: Quelle und physikalische Eigenschaften der Probe, Häufigkeit der Zielproteine sowie Komplexität und zelluläre Lage der Proteine. Wenn Sie diese Elemente Ihrer Probe verstehen, können Sie die möglichen Massenspektrometrieverfahren einschränken. Bei der Arbeit mit komplexen Proben kann es notwendig sein, spezielle Techniken zur Auswahl von Zielproteinen anzuwenden. Dies kann Workflows erfordern, die Folgendes beinhalten:

• Optimierte Zelllyse
• Subzelluläre Fraktionierung
• Abreicherung von abundanten Proteinen
• Anreicherung von ausgewählten Proteinen
• Werkzeuge für die Massenmarkierung

Jeder dieser Schritte kann eine Schlüsselrolle bei der Erzielung genauer Ergebnisse beim Nachweis oder der Isolierung von Proteinen spielen.

Lysatvorbereitung

Die physikalische Lyse ist eine Technik, die verwendet wird, um Zellen aufzubrechen und Zellinhalte zu extrahieren. Sie erfordert spezielle Geräte und Protokolle, da die Vorrichtungen oft sehr unterschiedlich sind. Dies kann sich in unterschiedlichen Einstellungen für die Beschallung oder sogar in unterschiedlichen Stößeln äußern.

Durch die Zelllyse werden die zellulären Kompartimente zerstört und endogene Proteasen und Phosphatasen aktiviert. Daher ist es wichtig, extrahierte Proteine vor dem Abbau durch die Aktivitäten dieser Enzyme zu schützen. Dies kann durch Zugabe eines Protease- und/oder Phosphatase-Inhibitors zu den Lyse-Reagenzien geschehen.

Es gibt einige Einschränkungen bei der Durchführung der Zelllyse, die Alternativen oder weitere Verarbeitungstechniken erfordern können. Die Lyse ist in der Regel nicht geeignet für kleine Probenvolumina oder die Handhabung von Proben mit hohem Durchsatz. Physikalische Lysemethoden allein lösen membranassoziierte Proteine nicht auf.

Reagenzienbasierte Lyseverfahren können jedoch Zellen lysieren und gleichzeitig Proteine auflösen. Durch den Einsatz verschiedener Puffer, Detergenzien, Salze und Reduktionsmittel kann die Zelllyse auf der Grundlage des jeweiligen Zelltyps oder der benötigten Proteinfraktion optimiert werden.

Um die Integrität des Zielproteins zu erhalten, müssen möglicherweise einige Detergenzien hinzugefügt und später wieder entfernt werden, um die Proteine korrekt untersuchen zu können. Auf diese Weise wird die langfristige Stabilität des extrahierten Proteins erhalten.

Abreicherung und Anreicherung

Das Ziel von Abreicherungs- und Anreicherungsstrategien ist es, Proteine mit hoher Abundanz zu entfernen oder Zielproteine in der Probe zu isolieren.

Die Abreicherung wird häufig verwendet, um die Komplexität einer biologischen Probe (wie Blut oder Serum, die hohe Konzentrationen von Albumin und Immunglobulinen enthalten) zu reduzieren. Um eine Abreicherung an einer Probe durchzuführen, stehen Immunaffinitätstechniken wie Immunpräzipitation, Co-Immunpräzipitation und kommerzielle Kits zur Verfügung. Der einzige bedeutende Nachteil dieser Technik besteht darin, dass sich abundant vorhandene Proteine oft an andere Proteine binden, was zu einer Abreicherung der Komplexe mit Proteinen mit geringer Abundanz führt.

Bei der Proteinanreicherung werden Unterklassen von zellulären Proteinen isoliert. Dies kann mit einer Reihe von Techniken erreicht werden, die einzigartige biochemische Aktivitäten, posttranslationale Modifikationen (PTMs) oder die räumliche Lokalisierung innerhalb einer Zelle identifizieren. Proteine können auch mit enzymklassenspezifischen Verbindungen oder zellundurchlässigen Markierungsreagenzien, die selektiv Zelloberflächenproteine markieren, angereichert werden.

Die Trennung verschiedener subzellulärer Fraktionen kann als Anreicherungsmethode verwendet werden. Dies kann durch Verfahren für den physikalischen Aufschluss, Detergenz-Pufferlösungen und Dichtegradientenmethoden erreicht werden. Diese Art der Trennung ist ideal, wenn man versucht, ein hydrophobes Membranprotein von einem hydrophilen Protein zu trennen.

Schließlich ist die Dichtegradientenzentrifugation eine weitere Technik, die sich ideal für die Isolierung intakter Zellkerne, Mitochondrien und anderer Organellen vor der Proteinauflösung eignet.

Dialyse und Entsalzung

Um sicherzustellen, dass eine Probe für den Aufschluss und die Analyse mittels Massenspektrometrie kompatibel und optimiert ist, können weitere Schritte wie Dialyse und Entsalzung erforderlich sein.

Die Massenspektrometrie misst geladene Ionen. Das bedeutet, dass Salze vor der MS entfernt werden sollten, um deren Nachweis zu minimieren (insbesondere Natrium- und Phosphatsalze). Dialyse und Entsalzung ermöglichen den Austausch von Puffern sowie die Entfernung kleiner Moleküle, um Interferenzen mit nachgeschalteten Prozessen zu vermeiden.

Denaturierung und Aufschluss von Proteinen

Der Aufschluss kann sowohl in einer Lösung als auch durch ein- oder zweidimensionale Gelelektrophorese erfolgen. Auf welche dieser Techniken die Entscheidung fällt, hängt vor allem von zwei Faktoren ab: der Probenmenge und der Komplexität.

Beim Aufschluss in einer Lösung werden die Proteine mit starken chaotropen Mitteln denaturiert und anschließend wird Reduktionsmittel hinzugegeben. Diese denaturierten und reduzierten Proteine werden daraufhin alkyliert, um die Neubildung von Disulfidbindungen irreversibel zu verhindern. Die alkylierten Proteine werden dann von Endoproteinasen aufgeschlossen, die Peptidbindungen hydrolytisch aufbrechen, um Proteine in Peptide zu fragmentieren.

Der Aufschluss in einer Lösung ist ideal, wenn Sie mit einer kleinen Probe arbeiten, da die Peptidextraktion beim Aufschluss in einem Gel zu einem erheblichen Peptidverlust führen kann. Der Aufschluss in einer Lösung eignet sich zudem am besten für Proben mit geringer bis mittlerer Komplexität, bei denen Detergenzien die Probe negativ beeinflussen würden. Hinsichtlich Dauer und Automatisierung wird der Aufschluss in einer Lösung bevorzugt. Er kann nicht nur schneller durchgeführt werden, sondern ist in der Regel auch in höherem Maße automatisiert.

Bei der Proteintrennung durch Gelelektrophorese wird die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet, um Proteine in einer Probe zu denaturieren und zu trennen. Nach der Elektrophorese werden die Proteinbanden sichtbar gemacht und anschließend aus dem Gel exzidiert. Die Gelpfropfen können dann reduziert, alkyliert und aufgeschlossen werden. Anschließend werden Peptide aus der Gelmatrix extrahiert, die dann für die MS-Analyse vorbereitet werden können.

Ein Vorteil des Aufschlusses in einem Gel besteht darin, dass er die Denaturierung der Proteine mit der Trennung kombiniert und so die relative Häufigkeit der Proteine in der Probe visuell anzeigt. Bei der Peptidextraktion wird auch ein großer Teil der Detergenzien und Salze entfernt, was jedoch die Peptidgewinnung beeinträchtigen kann.

Peptidanreicherung

In der letzten Phase der Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie wird die Anreicherung der Zielpeptide durchgeführt. Diese Phase ist zusammen mit der Probenaufbereitung für die erfolgreiche Analyse von Proteinen in geringer Menge oder die Identifizierung von posttranslational modifizierten Peptiden erforderlich.

Die Anreicherung erfolgt durch Affinitätsreinigung mit spezifischen Antikörpern oder Liganden, die sich selektiv an die Zielverbindungen binden.

Nach der Peptidanreicherung können Salze und Puffer mithilfe von Affinitätssäulen oder Detergenz-Präzipitationsreagenzien entfernt werden. In verdünnten Proben können auch Konzentratoren verwendet werden, die in einer Vielzahl von Molekulargewichtsbereichen (MWCO) vorliegen.

Zu diesem Zeitpunkt ist die gereinigte Peptidprobe bereit für die endgültige Vorbereitung zur MS-Analyse. Bei der LC-MS- oder LC-MS/MS-Analyse ist die korrekte Wahl der mobilen Phasen und der Ionenpaarungsreagenzien entscheidend, um eine gute LC-Auflösung für hochwertige Analyseergebnisse zu erzielen.

Gründe für das Scheitern der Proteinanalyse

Es gibt eine Reihe von Faktoren, die Ihre Probenvorbereitung verfälschen und zu einer unsachgemäßen Massenspektrometeranalyse führen können. Einer der häufigsten Stolpersteine bei der Massenspektrometrie sind Komplikationen bei der Analyse, da die Aminosäuren nicht identifiziert werden können. Nachfolgend sind die häufigsten Fehler, die diesem Irrtum zugrunde liegen, aufgeführt:

• Unzureichender Aufschluss der Proteine
• Das hydrophile/kleine Peptid läuft mit dem Salz durch die Backstage-Säule und kann nicht analysiert werden.
• Unzureichende Fragmentierung – die Peptide sind hydrophob oder zu groß und können nicht aus der Säule entfernt werden oder sie sind zu groß für die Analyse mittels MS
• Die Art und Weise der Peptidfragmentierung kann nicht analysiert werden. Mehrere Spektren sind in der Untersuchung unerklärt

Dinge, die Sie bei der Vorbereitung einer Proteinprobe vermeiden sollten

Ionisierung und Probenkonzentration

Ionisierungstechniken, die für große Moleküle verwendet werden, funktionieren oft gut, wenn das Probengemisch Bestandteile in gleichen Mengen enthält. Wenn dieses Gleichgewicht nicht gegeben ist, kann es zu Problemen kommen. Bei Proben mit einer großen Bandbreite an Proteinhäufigkeiten neigen die häufigeren Proteine dazu, Signale von weniger häufigen zu unterdrücken.

Vereinfachen Sie Ihre Probe

Die Analyse des Massenspektrums eines komplexen Gemischs stellt bereits aufgrund der großen Anzahl von Komponenten eine Herausforderung dar. Dies kann durch den enzymatischen Aufschluss einer Proteinprobe in eine große Anzahl von Peptidprodukten noch verschlimmert werden. Eine erfolgreiche Analyse hängt von einer sauberen Probe mit begrenzter Komplexität ab. Es ist wichtig, jegliche Komplexität zu minimieren, die eine Unterdrückung der Ionisierung oder eine zu geringe Probenahme der eluierenden Peptide verursachen würde.

Komplexe Proben und Anreicherung

Eine Herausforderung der Massenspektrometrie besteht darin, dass es schwierig sein kann, Proteine im Spurenbereich nachzuweisen, wenn sie in viel niedrigeren Konzentrationen vorliegen als andere biologische Produkte. Dies kann durch eine Überladung der Säule bekämpft werden, was jedoch auf Kosten der Ionisierungsunterdrückung und der Sättigung des MS-Detektors geht. Die Anreicherung von Proben durch Abreicherung von Produktproteinen ist ein langfristiges Ziel in diesem Bereich, das bereits einige Erfolge gezeigt hat.

Vor- und Nachteile der Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie bietet als Analysetechnik deutliche Vorteile:

• Höhere Empfindlichkeit als die meisten anderen Analysetechniken
• Ein Massenladungsfilter reduziert Hintergrundstörungen
• Hervorragende Spezifität unter Verwendung von Fragmentierungsmustern zur Identifizierung unbekannter Substanzen oder zur Bestätigung des Vorhandenseins von Verbindungen
• Informationen zum Molekulargewicht. Identifizierung unbekannter Verbindungen
• Daten über die Isotopenhäufigkeit von Elementen

Allerdings gibt es auch eine Reihe von Nachteilen:

• Unterscheidet nicht zwischen optischen und geometrischen Isomeren 
• Unterscheidet nicht zwischen den Positionen der Substituenten (in o-, m- und p-Position)
• Einschränkungen bei der Identifizierung von Kohlenwasserstoffen, die ähnliche fragmentierte Ionen erzeugen

Trotz der oben genannten Risiken und Einschränkungen besteht die größte Herausforderung bei der Massenspektrometrie in den unterschiedlichen Probentypen, denen Sie begegnen werden. Jede Probe ist einzigartig und kann sogar in unterschiedlichen Stadien der Probenvorbereitung erhalten werden.

Der Schlüssel zu Ihrem Erfolg liegt darin, zu wissen, wie Sie mit diesen Parametern umgehen müssen, um Proben herzustellen, die mit dem Massenspektrometer kompatibel sind. Dies erfordert Flexibilität, Kreativität und ein Verständnis für die vielen verschiedenen Optionen, die wir in der Probenvorbereitung betrachtet haben. Wenn Sie weitere Informationen über analytische Tests wünschen, besuchen Sie die Website von Avantor und erfahren Sie alles über die neuesten Entwicklungen in der Chromatographie und Massenspektrometrie.